Plasmide

Normaal gesproken produceren de bacteriën geen sgRNA en donorDNA-template die nodig zijn om het lacZ gen te kunnen bewerken. Bij dit practicum zullen jullie veranderingen bij de bacteriën aanbrengen d.m.v. het aanbieden van een of twee plasmides, die sgRNA en/of donorDNA-template bevatten. Deze plasmides zijn:

·       plZDonor

(Controle) bevat een donorDNA-template sequentie dat door het HDR-herstelmechanisme wordt gebruikt om de dubbelstrengsbreuk te repareren. De donor DNA-template bevat een specifieke insertie welke wordt ingebouwd in het lacZ gen. Hierdoor zal de werking van het gen beschadigd raken en dus niet of niet juist meer functioneren.

 ·       plZDonorGuide

Bevat zowel de donorDNA-template sequentie van de plZDonor alsook de sequentie die codeert voor sgRNA. Na transcriptie zal sgRNA het Cas9 eiwit geleiden naar de plek waar het lacZ gen moet worden geknipt. 

Beide plasmides bevatten een gen voor resistentie tegen de antibioticum spectinomycin.

Vooraf ingezette platen die tijdens het practicum worden verstrekt.