CRISPR in het practicum

CRISPR is het natuurlijk afweersysteem van prokaryoten tegen virussen. Aan de hand van de tekening hiernaast gaan we bekijken hoe een bacterie zich kan beschermen tegen virusaanvallen. In de tekening hiernaast zie je hoe het virus de bacterie aanvalt (nr.1) d.m.v. het injecteren van zijn eigen DNA. Door dit te doen zal het virus proberen de bacterie te kapen en de controle over te nemen. De reden voor deze overname ligt hem in het feit dat virussen niet in staat zijn om zich zelfstandig te kunnen voortplanten. Een virus heeft hiervoor altijd een gastheercel nodig, in dit geval een bacterie. Door de controle over te nemen zal de gastheercel de opdracht krijgen om nieuwe virussen te maken. Dit proces leidt in vele gevallen tot de dood van de gastheercel.

De respons van de bacterie op deze virusaanval zal zijn, ervan uitgaand dat het om een onbekend virus gaat, dat deze Cas 1 en Cas 2 eiwitten begint te produceren (nr.2). Cas staat overigens voor ‘CRISPR-associated genes & proteins’ en zoals je kunt zien liggen deze vlak voor de CRISPR-locatie. De geproduceerde Cas 1 en Cas 2 eiwitten vormen gezamenlijk een complex. Deze is in staat om een klein stukje van het viraal DNA er uit te knippen (nr.3) en daarna in te bouwen op de CRISP-locatie van het eigen genoom (nr.4). Deze CRISPR-locatie kan gezien worden als een enorme DNA-bibliotheek met steeds dezelfde korte stukjes eigen DNA, die we repeats noemen, en ingebouwde stukjes viraal DNA, die we spacers noemen. De afkorting voor CRISPR is dan ook van ‘clustered regularly interspaced short palindromic repeats’. Deze DNA-bibliotheek kan, als dat nodig is, door de bacterie worden aangewend om zichzelf te beschermen tegen virussen d.m.v. het produceren van CRISPR/Cas9 complexen. Een ander woord voor complex is samengesteld geheel en dat is voor het CRISPR/Cas complex niet anders.

Hoe dit CRISPR/Cas complex tot stand komt en waaruit dit bestaat gaan we nu nader bekijken. Zoals je hiernaast kunt zien vindt er transcriptie plaats van het tracrRNA gen, Cas9 gen en van de CRISPR-locatie (nr.5). Transscriptie houdt in dat er een stukje DNA wordt overgeschreven waardoor je, anders dan het dubbelstrengs DNA, een enkelstrengs kopie krijgt van RNA. Het stuk DNA dat tijdens transcriptie wordt overgeschreven, maakt deel uit van een gen. Als het gen codeert voor een eiwit ontstaat tijdens de transcriptie mRNA. Dit mRNA wordt dan vertaald in een werkzaam eiwit. Hiernaast kun je dus zien dat het cas9 gen codeert voor het werkzame cas9 eiwit. Cas9 is een nuclease ofwel een enzym dat nucleïnezuren (DNA of RNA) knipt. Voor het tracrRNA en pre-crRNA  dat is ontstaan naar de transcriptie geldt overigens niet dat zij coderen voor een eiwit, hier vervult het RNA een eigen functie in de cel. De rijping naar een werkzaam CRISPR/Cas complex verloopt verder na de transcriptie en tracrRNA, Cas9 en pre-crRNA gaan een binding aan met elkaar (nr.6). Zoals je kunt zien bestaat het pre-crRNA uit spacers en repeats. Het tracrRNA gaat een bindingen aan met het repeat gedeelte van het pre-crRNA. Het crRNA verbonden met het trcrRNA noemen we in zijn geheel gRNA (guideRNA ofwel gidsRNA). Het gRNA zit weer verbonden met Cas9. De rijping is compleet nadat het enzym RNAase III de pre-crRNA:tracr RNA splitst (nr.7) in een volwaardig werkend CRISPR/Cas9 complex (nr.8).

Als de bacterie dus nogmaals aangevallen wordt door hetzelfde soort virus, zal het gRNA het Cas9 enzym, waar het een complex mee vormt, begeleiden naar het viraal DNA. Op het virale DNA zal Cas9 alleen op bepaalde plekken kunnen binden, de zogenaamde protospacer adjecent motifs, kort gezegd PAM. Door deze binding wordt het door Cas9 mogelijk om het virale DNA gedeeltelijk open te ritsen. Deze opening maakt het mogelijk om het spacer gedeelte van het gRNA te passen op het virale DNA (nr. 9). Als deze past zal Cas9 het virale DNA doorknippen (nr.10), maar als het niet past gaan ze door naar de volgende PAM. De enorm hoge nauwkeurigheid van dit systeem en de mogelijkheid om heel specifiek op een bepaald stuk DNA te knippen bracht onderzoekers een paar jaar geleden op het idee om CRISPR/Cas te gebruiken voor genmodificatie in andere organismen.

Tegenwoordig wordt er dus over de hele wereld door onderzoekers gebruik gemaakt van CRISPR-Cas systemen. Hierbij is het goed om te onthouden dat CRISPR-Cas9 niet het enige CRISPR-systeem is. Dit is echter wel het systeem waar wij ons mee bezig zullen houden. Zoals hierboven als is weergegeven is CRISPR-Cas9 van origine het natuurlijke afweersysteem van prokaryoten. Onderzoekers hebben echter ontdekt hoe je CRISPR-Cas9 kunt gebruiken om op een gewenste plek zeer nauwkeurig veranderingen aan te brengen in het DNA. Deze veranderingen kunnen o.a. bestaan uit het knippen en of plakken van het DNA om zodoende ongewenste mutaties te vervangen of juist gewenste mutaties te creëren. Om hier een beter inzicht in te krijgen bekijken we nog eens goed waar het CRISPR-Cas systeem uit bestaat en hoe deze werkt.