Achtergrond informatie genbewerking

Gen bewerking omvat 2 stappen: Het doelgericht knippen van dubbelstrengs DNA en daarna het aansturen van DNA-reparaties om zo een gewenste sequentieverandering te verkrijgen. Wanneer chromosomaal DNA in een bacteriecel wordt geknipt ontstaat er een breuk. Als de cel niet in staat is om deze breuk te repareren, zal dit onherroepelijk tot de dood van deze cel leiden. Cellen zijn echter in staat om een dubbelstrengsbreuk op 2 verschillende manieren te repareren:

·     Nonhomolgous end Joining (NHEJ):

Het NHEJ-herstelmechanisme herstelt een dubbelstrengsbreuk door de twee uiteinden chemisch te herverbinden. Gedurende dit herstel kunnen er soms echter inserties of deleties (indels) van nucleotiden ontstaan. Wanneer dit voorkomt in een coderend gen kunnen deze indels enerzijds leiden tot een leesraamverschuiving en dus tot het ontstaan van een voortijdig stopcodon. Anderzijds kan het NHEJ aanleiding geven tot het toevoegen of wegvallen van drie nucleotiden (of een veelvoud) en dus tot het toevoegen of verdwijnen van aminozuren met een verandering van de eiwitfunctie tot gevolg. Het NHEJ-mechanisme wordt gebruikt voor de knock-out van genen.

·     Homology directed repair (HDR)

Het HDR-herstelmechanisme daarentegen herstelt de dubbelstrengsbreuk door middel van een homologe recombinatie. Het homologe streng kan enerzijds een dicht gelokaliseerde (en structureel gerelateerde) genomische sequentie zijn, bijvoorbeeld een zusterchromatide. Anderzijds kan het een extern toegevoegde donorDNA-template zijn. De homologe recombinatie o.b.v. een donorDNA-template kan aangewend worden voor het introduceren van specifieke inserties, deleties of puntmutaties. Het HDR wordt met andere woorden aangewend voor de knock-in van DNA-sequenties en dus voor specifieke gencorrecties.

Tijdens dit practicum zullen jullie gebruik maken van CRISPR-Cas9 om bacterieel chromosomaal DNA op een specifieke locatie binnen het lacZ gen te knippen. Hierbij profiteren wij van de cel zijn eigen HDR-herstelmechanisme om zo een gewenste sequentieverandering in het lacZ gen aan te brengen. Dit wordt bewerkstelligd door bacteriecellen van een grote hoeveelheid donorDNA-template te voorzien, welke een stopcodon insertie bevat die de genfunctie verstoord.